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• Characterization of an antifungal β-1,3-glucanase from <i>Ficus microcarpa</i> latex and comparison of plant and bacterial β-1,3-glucanases for fungal cell wall β-glucan degradation

  Takashima, T; Komori, N; Uechi, K; Taira, T

  PLANTA ( Planta )  258 ( 6 ) 116 - 116   2023年12月 [ 査読有り ]

  掲載種別: 研究論文（学術雑誌）

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  Each β-1,3-glucanase with antifungal activity or yeast lytic activity hydrolyzes different structures of β-1,3-glucans in the fungal cell wall, respectively. Plants express several glycoside hydrolases that target chitin and β-glucan in fungal cell walls and inhibit pathogenic fungal infection. An antifungal β-1,3-glucanase was purified from gazyumaru (Ficus microcarpa) latex, designated as GlxGluA, and the corresponding gene was cloned and expressed in Escherichia coli. The sequence shows that GlxGluA belongs to glycoside hydrolase family 17 (GH17). To investigate how GlxGluA acts to degrade fungal cell wall β-glucan, it was compared with β-1,3-glucanase with different substrate specificities. We obtained recombinant β-1,3-glucanase (designated as CcGluA), which belongs to GH64, from the bacterium Cellulosimicrobium cellulans. GlxGluA inhibited the growth of the filamentous fungus Trichoderma viride but was unable to lyse the yeast Saccharomyces cerevisiae. In contrast, CcGluA lysed yeast cells but had a negligible inhibitory effect on the growth of filamentous fungi. GlxGluA degraded the cell wall of T. viride better than CcGluA, whereas CcGluA degraded the cell wall of S. cerevisiae more efficiently than GlxGluA. These results suggest that the target substrates in fungal cell walls differ between GlxGluA (GH17 class I β-1,3-glucanase) and CcGluA (GH64 β-1,3-glucanase).

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    PubMed

• Structural Analysis and Construction of a Thermostable Antifungal Chitinase.

  Kozome D, Uechi K, Taira T, Fukada H, Kubota T, Ishikawa K

  Applied and environmental microbiology ( Applied and Environmental Microbiology )  88 ( 12 ) e0065222   2022年06月 [ 査読有り ]

  掲載種別: 研究論文（学術雑誌）

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    PubMed

• Preparation and Crystal Structure Analysis of High-Strength Film Derived from Nigeran Ester Derivatives

  Togo A.

  Journal of Fiber Science and Technology ( 一般社団法人 繊維学会 )  78 ( 8 ) 126 - 132   2022年 [ 査読有り ]

  掲載種別: 研究論文（学術雑誌）

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  <p>Nigeran (<i>α</i>-1,3-<i>alt</i>-<i>α</i>-1,4-glucan) is a linear glucan with alternating <i>α</i>-1,3- and <i>α</i>-1,4-glycosidic linkages. It is extracted from the cell walls of certain species in the genera <i>Aspergillus</i> and <i>Penicillium</i>. Nigeran can be esterified and used as a film, but its strength is only approximately 4–25 MPa. However, in the present study, high-strength nigeran ester films with tensile strengths of 100 MPa were successfully prepared by thermally stretching and annealing the melt-quenched films. Two-dimensional wide-angle X-ray diffraction (2D-WAXD) analysis revealed that the highly oriented films of nigeran butyrate (NGBu), nigeran valerate (NGVa), and nigeran hexanoate (NGHx) studied herein had two-fold helix symmetry along the molecular axis. Assuming the crystal systems to be orthorhombic, the unit lattice of each ester was calculated as NGBu (<i>a</i>=28.6Å, <i>b</i>=9.07Å, <i>c</i>=16.5Å), NGVa (<i>a</i>=31.5Å, <i>b</i>=9.07Å, <i>c</i>=16.2Å), and NGHx (<i>a</i>=36.7Å, <i>b</i>=9.07Å, <i>c</i>=16.2Å). In the calculated unit lattice parameters, only the <i>a</i>-axis was extended as the number of ester carbons increased.</p>

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    CiNii Research

• Identification of Genes Involved in the Synthesis of the Fungal Cell Wall Component Nigeran and Regulation of Its Polymerization in Aspergillus luchuensis

  Uechi K, Yaguchi H, Tokashiki J, Taira T, Mizutani O

  Applied and environmental microbiology ( Applied and Environmental Microbiology )  87 ( 21 ) e0114421   2021年10月 [ 査読有り ]

  掲載種別: 研究論文（学術雑誌）

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  Certain Aspergillus and Penicillium spp. produce the fungal cell wall component nigeran, an unbranched D-glucan with alternating α-1,3- and α-1,4-glucoside linkages, under nitrogen starvation. The mechanism underlying nigeran biosynthesis and the physiological role of nigeran in fungal survival are not clear. We used RNA-seq to identify genes involved in nigeran synthesis in the filamentous fungus Aspergillus luchuensis when grown under nitrogen-free conditions. agsB, which encodes a putative α-1,3-glucan synthase, and two adjacent genes (agtC and gnsA) were upregulated under conditions of nitrogen starvation. Disruption of agsB in A. luchuensis (ΔagsB) resulted in the complete loss of nigeran synthesis. Furthermore, overexpression of agsB in an Aspergillus oryzae strain that cannot produce nigeran resulted in nigeran synthesis. These results indicated that agsB encodes a nigeran synthase. Therefore, we have renamed the A. luchuensis agsB as nigeran synthase gene (nisA). Nigeran synthesis in an agtC mutant (ΔagtC) increased to 121%; conversely, that in ΔgnsA and ΔagtCgnsA decreased to 64% and 63%, respectively, compared to that in the wild-type strain. Our results revealed that AgtC and GnsA play an important role in regulating not only the quantity of nigeran but also its polymerization. Collectively, our results demonstrated that nisA (agsB) is essential for nigeran synthesis in A. luchuensis, whereas agtC and gnsA contribute to the regulation of nigeran synthesis and its polymerization. This research provides insights into fungal cell wall biosynthesis, specifically the molecular evolution of fungal α-glucan synthase genes and the potential utilization of nigeran as a novel biopolymer. Importance The fungal cell wall is composed mainly of polysaccharides. Under nitrogen-free conditions, some Aspergillus and Penicillium spp. produce significant levels of nigeran, a fungal cell wall polysaccharide composed of alternating α-1,3-/1,4-glucosidic linkages. The mechanisms regulating the biosynthesis and function of nigeran are unknown. Here, we performed RNA sequencing of Aspergillus luchuensis cultured under nitrogen-free or low-nitrogen conditions. A putative α-1,3-glucan synthase gene, whose transcriptional level was upregulated under nitrogen-free conditions, was demonstrated to encode nigeran synthase. Furthermore, two genes encoding an α-glucanotransferase and a hypothetical protein were shown to be involved in controlling nigeran content and molecular weight. This study reveals genes involved in the synthesis of nigeran, a potential biopolymer, and provides a deeper understanding of fungal cell wall biosynthesis.

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• Synthesis and characterization of α-1,3-<i>alt</i>-α-1,4-glucan (nigeran) ester derivatives (vol 214, 123343, 2021)

  Togo, A; Uechi, K; Mizutani, O; Kimura, S; Iwata, T

  POLYMER   226   2021年06月 [ 査読有り ]

  掲載種別: 研究論文（学術雑誌）

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• 遺伝子発現と微生物間相互作用から迫る糸状菌細胞壁多糖ニゲランの機能

  基盤研究(C)

  課題番号: 22K05410

  研究期間: 2022年04月  -  継続中 

• 遺伝子発現と微生物間相互作用から迫る糸状菌細胞壁多糖ニゲランの機能

  基盤研究(C)

  課題番号: 22K05410

  研究期間: 2022年04月  -  2025年03月 

  代表者: 上地 敬子 

  直接経費: 3,200,000（円）  間接経費: 4,160,000（円）  金額合計: 960,000（円）

• 黒色Aspergillus属特異的な細胞壁多糖ニゲランの機能と生合成機構の解明

  若手研究

  課題番号: 19K15737

  研究期間: 2019年04月  -  2022年03月 

  代表者: 上地 敬子 

  直接経費: 3,200,000（円）  間接経費: 4,160,000（円）  金額合計: 960,000（円）

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  Aspergillus luchuensisなどの一部のAspergillus属糸状菌は窒素飢餓時にニゲランという細胞壁多糖を生産することが知られている。しかしながらニゲラン合成のメカニズムや生理学的な意義については不明な点が多く知見が少なかった。A. luchuensisを供試菌として窒素源の存在/非存在下でのRNA-Seq解析を実施し，窒素源非存在時に特異的に発現量が増加するα-1,3-グルカン合成酵素遺伝子を見出した。そこで本研究では，ニゲラン合成酵素遺伝子の同定とニゲラン合成のメカニズムを明らかにすることを目的とした。RNA-Seq解析で見出したニゲラン合成酵素候補遺伝子を破壊したA. luchuensisはニゲラン合成能を完全に失い，またニゲラン生産能を持たないA. oryzaeに同遺伝子を導入した結果，ニゲラン生産能を付与することができた。つまり本遺伝子はα-1,3-グルカン合成酵素ではなくニゲラン合成酵素をコードする遺伝子であることが世界で初めて明らかとなった。ニゲラン合成酵素遺伝子破壊株について，液体培養とプレート培養の比較，各種細胞壁合成阻害剤を含む培養条件下での表現型解析を行ったが，いずれの条件下でも野生株との顕著な変化は確認されなかった。また，RNA-Seq解析結果より，ニゲラン合成酵素遺伝子に隣接し，窒素飢餓時に転写量が増加するα-グルカノシルトランスフェラーゼ様遺伝子と機能未知遺伝子が見出され，両遺伝子の翻訳産物がニゲランの生産量や分子量に影響を及ぼすことが示唆された。

• 黒色Aspergillus属特異的な細胞壁多糖ニゲランの機能と生合成機構の解明

  若手研究

  課題番号: 19K15737

  研究期間: 2019年04月  -  2022年03月 

  代表者: 上地 敬子 

  直接経費: 3,200,000（円）  間接経費: 4,160,000（円）  金額合計: 960,000（円）

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  Aspergillus luchuensisなどの一部のAspergillus属糸状菌は窒素飢餓時にニゲランという細胞壁多糖を生産することが知られている。しかしながらニゲラン合成のメカニズムや生理学的な意義については不明な点が多く知見が少なかった。A. luchuensisを供試菌として窒素源の存在/非存在下でのRNA-Seq解析を実施し，窒素源非存在時に特異的に発現量が増加するα-1,3-グルカン合成酵素遺伝子を見出した。そこで本研究では，ニゲラン合成酵素遺伝子の同定とニゲラン合成のメカニズムを明らかにすることを目的とした。RNA-Seq解析で見出したニゲラン合成酵素候補遺伝子を破壊したA. luchuensisはニゲラン合成能を完全に失い，またニゲラン生産能を持たないA. oryzaeに同遺伝子を導入した結果，ニゲラン生産能を付与することができた。つまり本遺伝子はα-1,3-グルカン合成酵素ではなくニゲラン合成酵素をコードする遺伝子であることが世界で初めて明らかとなった。ニゲラン合成酵素遺伝子破壊株について，液体培養とプレート培養の比較，各種細胞壁合成阻害剤を含む培養条件下での表現型解析を行ったが，いずれの条件下でも野生株との顕著な変化は確認されなかった。また，RNA-Seq解析結果より，ニゲラン合成酵素遺伝子に隣接し，窒素飢餓時に転写量が増加するα-グルカノシルトランスフェラーゼ様遺伝子と機能未知遺伝子が見出され，両遺伝子の翻訳産物がニゲランの生産量や分子量に影響を及ぼすことが示唆された。

• 微生物の代謝機能と酵素を利用した新しい希少糖およびヘテロ希少二糖生産技術の確立

  基盤研究(C)

  課題番号: 26450097

  研究期間: 2014年04月  -  2017年03月 

  代表者: 高田 悟郎, 櫻庭 春彦, 森本 兼司, 上地 敬子 

  直接経費: 3,900,000（円）  間接経費: 5,070,000（円）  金額合計: 1,170,000（円）

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  本課題は、D-アロース、D-アルトロース及びこれらの希少糖を含む二糖を新規の微生物の代謝機能と酵素を用いた新たな反応経路で生産する技術の確立のための基盤研究である。 本研究により、D-グルコシド3-デヒドロゲナーゼの大量生産に成功した。また、結晶化にも成功した。本酵素は様々な二糖類に作用し、化学的還元を組み合わせることで、α-1,4結合型、β-1,4結合型のアロシルグルコース、α-1,1結合型のアロシルアロース、β-1,4結合型のグロシルグルコースなど様々な希少糖含有二糖の生産が可能となった。

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• 黒麹菌細胞壁多糖ニゲラン分子量制御システムの解明と発酵生産系の確立

  研究費種類: 財団・社団法人等の民間助成金  参画方法: 研究代表者

  研究種別: 研究助成  事業名: 野田産研研究助成

  研究期間: 2021年04月  -  2022年03月 

  資金配分機関: 野田産業科学研究所

  直接経費: 1,000,000（円）